Исследования по применению трегалозы в криоконсервации клеток: криоконсервация OPC

D(+)-трегалозный дигидрат представляет собой стабильный невосстанавливающий дисахарид. Он может образовывать защитную пленку на поверхности клеток при различных нагрузках окружающей среды, таких как экстремальная жара, холод, засуха, эффективно защищать структуру биологических макромолекул от повреждений. Он обладает отличной неспецифической защитной функцией для биологических клеток и может улучшить устойчивость биологических клеток к суровым условиям.

В последние годы, двугидрат д (+)-трегалозы широко был использован в биологических продуктах включая лекарства антитела. Он используется в качестве защитного агента примерно для 30% препаратов антител на рынке (включая АЦП), таких как Adcetris, Padcev, Imjudo, Kimmtrak и т. Д.

D(+)-трегалозный дигидрат также играет все более важную роль в криоконсервации клеток, вспомогательной репродукции и других областях. Здесь команда продуктов AVT интерпретирует следующую связанную литературу, чтобы помочь вам понять соответствующий прогресс исследований.

D(+)-трегалозный дигидрат для криоконсервации OPC

1. Трансплантация клеток-прекурсоров олигодендроцитов (OPCs) для демиелинизирующих заболеваний

Демиелинизирующие заболевания-это неврологические расстройства, характеризующиеся потерей миелиновой оболочки, такие как повреждение спинного мозга (SCI), рассеянный склероз (MS) и т. Д.

OPCs могут дифференцироваться в зрелые олигодендроцитыIn vivo, Которые являются важными миелинизирующими клетками центральной нервной системы и инкапсулируют нейронные аксоны, образуя миелиновые структуры. Таким образом, трансплантация OPC считается весьма потенциальной терапией для демиелинизирующих заболеваний.

2. Существующие методы и проблемы криоконсервации OPC

Криоконсервация OPC является критическим шагом в успешной трансплантации OPC человека.

Перед клиническим использованием OPCs человека были криоконсервированы криопротектором 100 мл/л ДМСО + 900 мл/л FBS (метод, предложенный в 1984 году) со скоростью восстановления от 55% до 70%. Метод не был оптимизирован в течение длительного времени после этого.

Учитывая, что ДМСО является цитотоксическим, а ФБС иммуногенным, вышеуказанный метод криоконсервации не подходит для клинического применения.

Чтобы исследовать более экономичный, эффективный и безопасный метод криоконсервации OPC человека, который можно применять в больших масштабах, Лю Чан из Южного медицинского университета и другие исследователи оптимизировали вышеупомянутый метод с использованием OPC, индуцированных нервными стволовыми клетками головного мозга человека (hNSCs).

3. Оптимизация методов для криоконсервации OPC

① Сравнивая влияние различных методов на скорость восстановления OPCs, было обнаружено, что выживаемость клеток, собранных пищеварением, была значительно выше, чем при механическом пипетировании.

1

Таблица 1: Жизнеспособность клеток и скорость восстановления до и после криоконсервации с использованием методов механического нарушения и пищеварения

、 Группа Механическая группа Digestion Group

A 、 B Криозащитное средство A Криозащитное средство B

、 ViЖизнеспособность до криоконсервации Жизнеспособность после выздоровления

② Сравнивая скорость восстановления криоконсервированных OPC с четырьмя различными криоконсервационными средами путем медленного охлаждения в морозильной камере и быстрого охлаждения в баке с жидким азотом в паровой фазе.

Как показано ниже, была статистически значимая разница в скорости восстановления для двух скоростей охлаждения. Скорость восстановления для четырех криопротекторов была менее 30% при быстром охлаждении. Скорость восстановления для криоконсервационной среды E, дополненной дигидратом D(+)-трегалозы, была самой высокой при медленном охлаждении в морозильной камере, которая составляла (75,73 ± 6,66) %.

③ Сравнение влияния продолжительности криоконсервации на скорость восстановления OPC

Клетки, криоконсервированные в криоконсервационной среде Е с наибольшей скоростью восстановления, были отобраны для последующих экспериментов, и скорость восстановления сравнивали между кратковременной (<2 месяцев) криоконсервацией и долгосрочной (6 месяцев) криоконсервацией, не показывая существенной разницы в скорости восстановления между двумя группами.

④ Сравнение активности пролиферации клеток

Криоконсервационная среда Е с наибольшей скоростью восстановления была выбрана для сравнения пролиферации клеток. Средний множитель пролиферации сравнивали между группой криоконсервационной среды Е и нормальной контрольной группой культуры после 3 раз последовательного прохождения в одно и то же время, и между двумя группами не было значимой разницы. После 7 дней культивирования не было никакой существенной разницы в скорости пролиферации между нормальной культурной группой и группой культуры после оттепели. Результаты показали, что активность пролиферации клеток OPC криоконсервирована с криоконсервационной средой, содержащей D(+)-трегалозный дигидрат, которая была сопоставима с активностью незамороженных клеток.

Заключение

В исследовании сделан вывод о том, что индуцированные hNSC OPCs, собранные путем пищеварения и культивируемые адгезивно, могут быть криоконсервированы полной средой OPS, содержащей 70 мл/л ДМСО + 300 мл/л FBS + 0,2 моль/мл D(+)-двугидрат трегалозы в течение длительного времени путем медленного охлаждения и быстрого согревания в морозильной камере, со средней скоростью восстановления до 75%. Восстановление после криоконсервации не влияло на экспрессию OPC-специфических маркеров и способность к пролиферации.

D(+)-трегалозный дигидрат является нетоксичным криопротектором, непроницаемым для клеточных мембран, из многих источников, который, как было доказано, обладает хорошим эффектом криоконсервации для различных типов клеток, таких как hPBSC и hESC. В этом исследовании, среда криоконсервации дополненная с низкой концентрацией дигидрата д (+)-трегалозе достигла самой высокой скорости восстановления во всех экспириментально группах, и результаты экспрессии пролиферации и отметки после культуры показали что среда криоконсервации добавленная с д (+)-двугидрат треалозы был также соответствующий для криоконсервации человеческих ОПК и смог улучшить тариф спасения клеток.