Перспективы замораживания альгината при криоконсервации клеток: замораживание плюрипотентных стволовых клеток человека с помощью альгината

В первых трех вопросах мы поделились исследованиями дигидрата D(+)-трегалозы в криопротекции клеток-предшественников олигодендроцитов человека (OPCs), стволовых клеток (ADSCs), зародышевых клеток яичек мыши и т. Д. Эти исследования показали, что добавление подходящего количества D(+)-трегалозы дигидрата в криоконсервационную среду или использование криопротектора (CPA) Содержа двугидрат д (+)-треалосе и глицерин может улучшить тариф спасения клеток после долгосрочной криоконсервации.

В этом выпуске мы развиваем четкое понимание криопротекторного эффекта дигидрата D(+)-трегалозы в трех различных линиях плюрипотентных стволовых клеток человека через статью, опубликованную вИсследование стволовых клетокВ 2018 году исследователями из Милана, Италия.

Криоконсервация плюрипотентных стволовых клеток человека с дигидратом D(+)-трегалозы

Введение

Продукты клеточной терапии, включая стволовые клетки, обладают высоким клиническим потенциалом. Глобальный рынок стволовых клеток включает в себя хранение и подготовку стволовых клеток в верхнем и среднем потоке, а также клинические применения. Согласно отчету Transparency Market Research (TMR), мировой рынок стволовых клеток, как ожидается, достигнет 270,5 млрд долларов США к концу 2025 года, а совокупные ежегодные темпы роста рынка находятся на пути к достижению 13,8% за последние 8 лет.

Чтобы обеспечить успешное применение продуктов клеточной терапии, долгосрочная криоконсервация клеток является технической трудностью, которую необходимо преодолеть, поскольку криоконсервация является единственным доступным методом долгосрочного сохранения жизнеспособности и биохимической функции клеток.

Чтобы избежать повреждения клеточных структур, вызванных внутриклеточным замораживанием, криопротекторы разрабатываются и продаются. Наиболее часто используемыми криозащитными средствами для клеток являются диметилсульфоксид (ДМСО) в сочетании с фетальной бычьей сывороткой (FBS) или любым заменителем сыворотки.

Однако FBS содержит ксеногенные белки животного происхождения, которые могут вызывать зоонозные инфекции с неизвестными патогенами. Кроме того, ДМСО является цитотоксическим. Сообщается, что токсичность ДМСО на ткани и клетки напрямую связана со временем воздействия, температурой и концентрацией. Степень токсичности варьируется в зависимости от типа клеток, и сообщалось о побочных эффектах у пациентов, повторно вводивших размороженные клетки без удаления ДМСО. Кроме того, известно, что ДМСО влияет на эпиген эмбриоидов мышей, регулируя уровни транскриптов трех ДНК-метилтрансфераз (Dnmts) и изменяя профили метилирования генома, что, в свою очередь, приводит к неконтролируемой дифференцировке стволовых клеток мыши. По всем этим причинам, DMSO + FBS не подходит для клинического применения. Существует острая необходимость в разработке эффективных и нетоксичных криопротекторов.

D(+)-трегалозный дигидрат является невосстанавливающим дисахаридом, обнаруженным в различных организмах, способных пережить полное обезвоживание, таких как бактерии, дрожжи, тихоходки и нематоды. Млекопитающие не производят D(+)-трегалозы двугидрат, но это эффективное cryoprotectant клеток млекопитающих, которые могут уменьшить повреждение клеток, вызванное образованием кристаллов льда. Защитное влияние двугидрата д (+)-треалосе связано с осмотическим влиянием и специфическим взаимодействием фосфолипидов клеточной мембраны и лабильных протеинов, которые могут предотвратить повреждение и денатурацию клетки должное к высыханию и оксидативному стрессу.

Не-цитотоксический дигидрат д (+)-трегалозы эффектно был использован для криоконсервации различных типов клеток как сперматоциты мыши, взрослые кроветворные стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки, адипосе-производные стволовые клетки (АДСК), человеческие эмбриональные стволовые клетки (хЭСК) и человека-индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs). D(+)-трегалозный дигидрат также используется для криоконсервации пуповинной крови, костного мозга и островков человека.

Основным препятствием, препятствующим широкому использованию дигидрата D(+)-трегалозы в сохранении клеток, является то, что дигидрату D(+)-трегалозы трудно получить доступ к внутренней части клетки. Ранее для решения этой проблемы применялось несколько средств, таких как осмотический шок, доставка липосом, тепловая перфорация, электропорация, микроинъекция и генная инженерия. Однако вышеперечисленные методы требуют сложных операций, являются трудоемкими и трудоемкими, и могут привести к значительному повреждению клеток.

В этом исследовании три различных типа линий плюрипотентных стволовых клеток были криоконсервированы четырьмя различными криопротекторами, полученными с использованием дигидрата D(+)-трегалозы отдельно или в комбинации с этиленгликолем или глицерином, соответственно. Затем клеточные линии размораживали для исследования ключевых параметров, включая морфологию клеток, жизнеспособность после оттаивания, уровни экспрессии маркеров плюрипотентности, геномную стабильность, гомеостаз эндоплазматического ретикулума (ER) и ответ на повреждение ДНК, измеряя криозащитный колпачок.Стойкость четырех криопротекторов на плюрипотентных стволовых клетках.

Различные составы криопротектора

Все криопротекторы были свежеприготовлены и разбавлены в фосфатном буферизованном солевом растворе (PBS). Клетки, используемые в исследовании, были криоконсервированы с использованием CS10. CS10, содержащий 10% ДМСО, представляет собой криопротектор, не содержащий сывороточных и животных компонентов, который рекомендуется для криозащиты плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC).

Криоконсервация и оттаивание клеток

Культивировать клетки в определенных условиях. Разобщите hESCs-RC17 с 0,5 мМ ЭДТА, обработайте hiPSCs-CTR2 #6 и ltNES-AF22 растворами для отслоения клеток и храните в свежеприготовленных криопротекторах (A, B, C и D). Ресуспенд 2,0 × 10 ^ 6 клеток в 1,5 мл каждого криопротектора и перенос в криогенные флаконы.

Охладите криогенные пробирки в замерзая контейнере на приблизительно-1 ℃/минута, и передаче к замораживатель на-80 ℃ после ночного хранения. Через 24 часа перенесите криогенные флаконы в жидкий азот для хранения не менее одной недели.

Грейте криогенные пробирки в водяной бане на 37 ℃ до тех пор пока масса льда не исчезнет, и разбавьте суспензию клетки с теплой средой. Собирают клетки 200 г ткани центрифугированием в течение 3 мин и засевают на покрытые культуральными сосудами сосуды, подходящие для каждого типа клеток при указанном размере инокулята.

Результаты и обсуждение

① Жизнеспособность клеток

Измерьте жизнеспособность клеток с помощью агента alamarBlue через 48 часов после размораживания.

Во-первых, для определения соответствующего количества дигидрата D(+)-трегалозы, этиленгликоля и глицерина использовали различные концентрации однокомпонентных растворов для различных линий стволовых клеток. Жизнеспособность клеток после размораживания измеряли и сравнивали с контрольными группами. Результаты показали, что 0,5 М D(+)-трегалозы дигидрат, 10% этиленгликоля и 10% глицерина были подходящими количествами, но были большие различия между различными типами стволовых клеток.

После определения начальной концентрации четыре различных криопротектора (см. выше) были использованы для криоконсервации трех линий стволовых клеток: (Группа A) hESCs-RC17, (Группа B) hiPSCs-CTR2 #6 и (Группа C) ltNES-AF22. Жизнеспособность клеток была измерена после оттаивания. Показатель выживаемости клеток также сравнивали с теми же клетками, криоконсервированными в CS10 при тех же условиях.

Когда клетки были криоконсервированы только дигидратом D(+)-трегалозы (группа А), скорость восстановления клеток после оттаивания уменьшалась, варьируя от 20% до 60% для различных типов клеток.

Когда среду на основе дигидрата D(+)-трегалозы дополняли 10% этиленгликолем или 10% глицерином (группы C и D), выживаемость клеток у hESCs-RC17 и ltNES-AF22 достигала тех же уровней, что и у криоконсервированных в ДМСО. Тем не менее, выживаемость клеток hiPSCs-CTR2 #6, криоконсервированных в глицерине, была лучше, чем в этиленгликоле.

Кроме того, сравнивая результаты с контрольными криопротектами, содержащими только этиленгликоль или глицерин, было подтверждено, что повышение выживаемости было обусловлено сочетанным действием этиленгликоля/глицерина + D(+)-трегалозы дигидрата.

Эти результаты предлагают что дигидрат д (+)-треалосе можно использовать для криоконсервации человеческих плюрипотентных стволовых клеток и ожидано, что заменяет ДМСО, и добавление гликоля этилена 10% или глицерола 10% может значительно улучшить выживаемость криопротектантов треалосе. Средняя выживаемость клеток была увеличена по сравнению с CS10. Криопротекторы этиленгликоль/глицерин и D(+)-трегалозы дигидрат не содержат сывороточных белков и позволяют избежать ранее сообщенного риска стимуляции преждевременной дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток.

② Морфология клеток

Другая проблема сКриоконсервация стволовых клеток представляет собой хромосомные и плюрипотентные изменения. Во время замораживания и оттаивания кристаллы льда и пузырьки могут образовываться внутри и снаружи клеток, разрушая веретенообразные микротрубочки, вызывая аномальную сегрегацию хромосом и приводя к изменениям характеристик роста и морфологии клеток. Поэтому возможность повреждения хромосомы и плюрипотентного потенциала стволовых клеток можно легко оценить, наблюдая за морфологией клеток после оттаивания.

На верхнем рисунке показана морфология клеток hESCs-RC17, hiPSCs-CTR2 #6 и ltNES-AF22 через 48 часов после оттаивания. Изображения фазового контраста показали, что составные криопротекторы D( )-трегалозы дигидрат не вызывают значительных морфологических изменений ни в одной из клеточных линий, и морфология клеток была идентична морфологии клеток, сохраненных в CS10.

③ Уровень выражения маркера

Чтобы подтвердить, что hESCs-RC17, hiPSCs-CTR2 #6 и ltNES-AF22 после оттаивания сохранили ключевые свойства и характеристики плюрипотентных стволовых клеток, уровни экспрессии нескольких маркеров были проанализированы количественным методом через 48 часов после оттаивания.

Клеточные маркеры Nanog, Oct4 и Sox2 были обнаружены для hESCs-RC17 и hiPSCs-CTR2 #6 и сравнены с контрольными группами.

Нестин и Sox2 были обнаружены для ltNES-AF22 и сравнены с контрольными группами. Результаты показали, что потенциал дифференцировки стволовых клеток не был затронут.

④ Стабильность хромосом

Для оценки влияния криопротекторов на основе дигидрата D( )-трегалозы на стабильность хромосом в стволовых клетках было проведено традиционное кариотипирование и aCGH на всех трех линиях стволовых клеток. На рисунке ниже показаны результаты ltNES-AF22 до и после криоконсервации.

В целом, кариотипы оставались стабильными, но были обнаружены вариации числа копий (CNV) (хромосомы 2, 8, 19 и 22). Некоторые из CNV могут присутствовать в первичных клетках, а другие могут возникать случайным образом во время манипуляций с клетками in vitro, а не криоконсервации, поскольку до (рисунок C) и после (рисунок D) криоконсервации не наблюдалось клональной анеуплоидии или структурных хромосомных аберраций.

⑤ ER стресс/развернутая оценка уровня белка

Исследование также было сосредоточено на том, влияет ли криоконсервация в дигидрате CS10 или D( )-трегалозы на способность плюрипотентных клеток реагировать на стресс эндоплазматического ретикулума (ER) и активировать развернутый белковый ответ (UPR). Для поддержания гомеостаза в различных физиологических или патологических условиях, ER интегрирует различные молекулярные и клеточные сигналы. И ER стресс и UPR опосредуют молекулярные и биохимические механизмы, которые влияют на пролиферацию клеток, дифференцировку и апоптоз.

В целом, D( )-трегалозный дигидрат демонстрировал умеренный уровень ER-стресса/UPR по сравнению с CS10. Единственная более чувствительная клеточная линия была hiPSCs-CTR2 #6, которая показала более высокие уровни экспрессии генов BIP и CHOP в группах B и C, что указывает на то, что криоконсервация дигидратом D( )-трегалозы значительно не изменяла гомеостаз ER мультипотентных стволовых клеток по сравнению с CS10.

Заключение

Долгосрочная криоконсервация стволовых клеток имеет большой потенциал применения во многих областях, таких как трансплантация клеток и клеточная терапия. Несколько исследований оптимизировали средства для криоконсервации плюрипотентных стволовых клеток человека, и долгосрочное криоконсервация с дигидратом D( )-трегалозы может быть идеальным методом.

Человеческие плюрипотентные стволовые клетки, сохраненные в криопротекторах дигидрата D( )-трегалозы, сохраняют клеточные фенотипы и функциональные свойства, указывая на потенциальные применения дигидрата D( )-трегалозы в клинической терапии. Хотя дальнейшие исследования необходимы для оценки биобезопасности клеток криоконсервированных с составными криопротектантами дигидрата д ( )-трегалозы, двугидрат д ( )-трегалозы сочетания из с гликолем этилена или глицеролем, как криопротектант биобезопасности без цитотоксичности или животных-производных клинических протеинов, показывает большое обещание для.